En lo que respecta a la línea de tiempo de los acontecimientos que dieron lugar a esta nueva tecnología, el descubrimiento de CRISPR y su función se remonta a 1993, momento en el cual Francisco Mojica, investigador de la Universidad de Alicante (España) caracterizó por primera vez el locus CRISPR. Trabajando en éste durante los noventa y comienzos del siglo XXI descubrió que este conjunto de secuencias altamente repetidas dispares compartía un set de características distintivas (Mojica et al., 2005).
En 2005 se descubrió que estas secuencias se correspondían con fragmentos del genoma de bacteriófagos, y esto permitió a los investigadores hipotetizar, lo que posteriormente corroborarían, que CRISPR consiste en un sistema inmune adaptativo. A estos resultados llegó otro grupo coetáneamente (Pourcel et al., 2005).
El descubrimiento de la nucleasa Cas9 y del dominio PAM tuvo lugar en 2005, cuando el grupo de Alexander Bolotin, el cual se encontraba estudiando Streptococcus thermophilus, encontró en esta bacteria un locus CRISPR inusual. En él no se encontraban los genes Cas habituales, y en su lugar se hallaba nuevos genes Cas entre los que se incluía uno que codificaba para una gran proteína que se predijo que tendría actividad nucleasa. Además, se encontró que en la región espaciadora se tenía homología con los genes virales. Esta secuencia, conocida como Protospcer Adjacent Motif (PAM), es esencial para el reconocimiento de la diana (Bolotin et al., 2005).
LOS PRIMEROS AVANCES
Posteriormente, en 2006, el grupo de Koonin, en su estudio por análisis computacionales de clusters de proteínas ortólogas, propusieron un esquema hipotético para la cascada de señalización de CRISPR como sistema de defensa basado en inserciones homólogas del DNA del fago en una matriz espaciadora natural, lo que permitió abandonar la idea de las proteínas cas como sistema de reparación de DNA (Makarova et al., 2006).
La demostración experimental de CRISPR como sistema inmune adaptativo tuvo lugar en 2007, y la causa fue el estudio de Streptococcus thermophilus por su importancia en la industria alimentaria. El grupo de Philippe Horvath, de Danisco, buscó explorar la respuesta de estas bacterias al ataque por parte de fagos, un problema bastante extendido en l producción del yogurt. Para ello integraron DNA nuevo de fago en la matriz CRISPR, lo cual permitió combatir las siguientes oleadas de fagos y se demostró que cas9 es la única proteína requerida para la interferencia siendo éste el sistema por el que CRISPR desactiva al fago invasor (Barrangou et al., 2007).
En agosto de 2008 el grupo de John van der Oost, de la Universidad de Wageningen (Holanda) mostraron que en Escherichia coli las secuencias espaciadoras derivadas del fago se transcribían en pequeños RNA a los cuales se denominó CRISPR RNA, crRNAs. Dichos crRNAs guiaban a la proteína Cas hacia el DNA blanco. En diciembre del mismo año Luciano Marraffini y Erik Sontheimer demostraron que la molécula diana de este sistema es el DNA, no el RNA (Marraffini and Sontheimer, 2008). No obstante, estudios posteriores han demostrado que un diferente tipo de sistema CRISPR puede tener como objetivo el RNA (Hale et al., 2009).
A PARTIR DE 2010
En diciembre de 2010, Moineau et al. demostraron que el sistema CRISPR-Cas9 creaba roturas de doble cadena en el DNA diana en posiciones precisas, tres nucleótidos aguas arriba de PAM. También confirmaron que Cas9 es la única proteína requerida para realizar la escisión en este sistema (Garneau et al., 2010).
En marzo de 2011 Emmanuelle Charpentier et al. realizaron la secuenciación de los RNA pequeños de Streptococcus pyogenes, que contenía el sistema CRISPR-Cas9. Descubrieron que, además del crRNA, existía un segundo RNA pequeño, al cual denominaron trans-activating CRISPR RNA, tracrRNA; y mostraron que este tracrRNA forma un dúplex con el crRNA y que es realmente este dúplex el que guía a Cas9 hacia su diana (Deltcheva et al., 2011). En julio del mismo año Virginijus Siksnys et al., de la Universidad de Vilna, Lituania, clonaron enteramente el locus CRISPR-Cas de Streptococcus thermophilus, que posee un sistema tipo II, y lo expresaron en Escherichia coli, que no tiene un sistema de tipo II, de modo que se demostró que este sistema era capaz de proporcionar resistencia a plásmidos, lo que sugiere que CRISPR-Cas es un sistema que está formado por unidades autónomas (Sapranauskas et al., 2011).
En septiembre de 2012 el grupo de Virginijus Siksnys llevó a cabo la caracterización bioquímica de la escisión mediada por Cas9, para lo cual se sirvieron de su sistema heterólogo previamente mencionado. Purificaron entonces Cas9 en un complejo con el crRNA de E. coli y mediante una serie de experimentos caracterizaron el modo de acción Cas9; verificaron su sitio de escisión y la necesidad de portar el dominio PAM. También, al realizar mutaciones puntuales, demostraron que el dominio RuvC escinde la cadena no complementaria, mientras que el dominio HNH realiza la escisión en el sitio complementario; que el crRNA podría recortarse hasta un fragmento de veinte nucleótidos de forma que fuera suficiente para que pudieran seguir realizando el corte, y que podían reprogramar Cas9 para dirigirla a un sitio a su voluntad cambiando la secuencia de este crRNA (Gasiunas et al., 2012).
Para finalizar esta introducción, en enero de 2013, el grupo de Feng Zhang, que previamente había trabajado en otros sistemas de edición génica como TALEN, fue el primero en adaptar de forma exitosa CRISPR-Cas9 para la edición del genoma de células eucariotas. Diseñaron para ello dos ortólogos de Cas9 (de S. thermophilus y de S. pyogenes) demostrando que era posible la escisión dirigida en el genoma de células humanas y de ratón. Con ello demostraron asimismo que el sistema podía reprogramarse para apuntar a múltiples loci en el genoma, y que podía conducir la reparación homóloga (Cong et al., 2013). Investigadores del laboratorio de George Church en la Universidad de Harvard alcanzaron con su proyecto hallazgos similares (Mali et al., 2013).
[…] Todo el mundo habla de la tecnología CRISPR pero en ocasiones su comprensión puede resultar prolija. Para facilitar su entendimiento lanzamos esta guía en la que se explican los conceptos básicos para entender la tecnología CRISPR: qué es, cómo funciona, qué es el CRISPR-Cas y el CRISPR-Cas9, sus aplicaciones actuales y potenciales, y su diferencia con las técnicas transgénicas. Podéis descargar la guía pinchando en la siguiente imagen. Y podéis conocer más sobre la historia de su descubrimiento en este enlace. […]